Virgilio dedicó los últimos once años de su vida a componer la Eneida, una epopeya mitológica en doce libros que relata las peripecias del héroe Eneas durante siete años, desde la caída de Troya hasta su victoria militar en Italia.

En esta obra, Virgilio se propone describir su Roma ideal y, en cierto modo, prefigurar los acontecimientos de la historia romana. Eneas huye de Troya con su anciano padre, Anquises, sobre sus hombros y su hijo Ascanio de la mano. Consigue reunir una flota y zarpa con los supervivientes troyanos rumbo a Tracia, Creta, Epiro y Sicilia, antes de ser abordado en las costas de África. Allí, Dido, reina de Cartago, se enamora de Eneas y se suicida tras su partida. Tras atracar en la desembocadura del río Tíber, en Italia, Eneas da muerte a Turno, rey de los rútulos, en una lucha por conseguir la mano de Lavinia, princesa del Lacio. Según Virgilio, el pueblo romano desciende directamente de Ascanio, fundador de Alba Longa, la ciudad que más tarde se convertiría en Roma.

El estilo de la Eneida y su tratamiento están inspirados en las antiguas epopeyas griegas, la Iliada y la Odisea de Homero. Virgilio también se inspiró en parte en el poema épico Argonáutica, escrito por el poeta griego del siglo III a.C. Apolonio de Rodas, así como en los Anales del poeta romano Quinto Ennio, que fue el primero en introducir el hexámetro dactílico en la poesía épica latina (Véase Versificación). Virgilio introdujo en la Eneida la musicalidad y la precisión técnica de su métrica de un modo tan sutil que su verso se ha considerado desde entonces como un modelo de perfección literaria.

La Eneida está considerada generalmente como la primera gran epopeya literaria, puesto que la Iliada posee una gran riqueza artística pero contiene un gran número de recursos ya usados en la poesía oral anterior.

La Eneida, a diferencia de la Iliada, no es una parte heredada de la conciencia nacional, sino más bien un intento deliberado de glorificar a Roma, por encargo de Augusto, cantando el supuesto origen troyano de sus gentes y, en especial, los logros e ideales de Roma bajo su nuevo emperador. Los elementos históricos y augustos son especialmente notorios entre los libros 5-8, la parte central del poema. La Eneida puede considerarse una obra universal, por su estructura ambiciosa, su belleza estilística y su preocupación por las tribulaciones del individuo.

La Eneida fue una obra muy apreciada en su época. Durante la edad media se encontró en ella un sentido filosófico, y Virgilio fue considerado casi un vidente y un mago. Dante realiza un homenaje a Virgilio en la primera parte de la Divina Comedia, convirtiéndole en guía del poeta a través del Infierno y del Purgatorio, hasta llegar a las puertas del Paraiso. Pero fue la devoción de Petrarca por el estilo virgiliano, lo que convirtió a Virgilio en una referencia constante en el humanismo en el renacimiento.